พัฒนาการของความรู้ความเข้าใจเกี่ยวกับ RNAi คาดว่าเริ่มขึ้นเมื่อ ในปี 1990 Jorgensen และคณะ รายงานปรากฏการณ์ที่เขาทำการทดลองในการพยายามทำให้สีของดอกพิทูเนีย (petunia) มีสีเข้มขึ้น โดยการใส่ยีนที่จะกระตุ้นการสร้างรงควัตถุสีแดงจากภายนอกเข้าไป แต่ผลที่พบ คือ ยีนสารสีของดอกพิทูเนีย หยุดการทำงานลง ซึ่งในขณะนั้นยังไม่สามารถอธิบายได้ว่าอะไรเป็นสาเหตุของปรากฏการณ์ดังกล่าว แต่เมื่อมองย้อนกลับไป อาจถือได้ว่า Richard Jorgensen และคณะเป็นกลุ่มบุคคลแรกที่รายงานถึงลักษณะที่คล้ายกับผลจากการเกิดกระบวนการ RNAi ในปีเดียวกันนี้ยังมีการค้นพบปรากฏการณ์ที่คล้ายกันอีกโดย van der Krol และคณะเมื่อทำการใส่ dihydroflavonol-4-reductase (DFR) or chalcone synthase (CHS) genes เข้าไปในดอกพิทูเนียและ Smith และคณะเมื่อทำการใส่ chimaeric polygalacturonase (PG) gene ในมะเขือเทศ ซึ่งในปี1990 นี้ได้มีการกำหนดชื่อเรียกปรากฏการณ์ดังกล่าวว่า post transcriptional gene silencing (PTGS) ต่อมาในปี 1992 Macino และ Romano ได้มีการค้นพบปรากฏการณ์ที่ใกล้เคียงกันใน Neurospora crassa เมื่อใส่ยีนที่ทำให้มีการแสดงลักษณะเผือกโดยพบว่า Neurospora crassa บางส่วนไม่มีการแสดงลักษณะเผือก ซึ่งMacino และRomano เรียกปรากฏการณ์ดังกล่าวว่า quelling อย่างไรก็ตามยังไม่มีผู้ที่สามารถอธิบายได้ว่าอะไรคือกลไกที่ทำให้เกิดลักษณะดังกล่าว จนกระทั่งในปี 1998 มีนักวิทยาศาสตร์ชาวอเมริกัน 2 คน คือ Andrew Z. Fire และ Craig C. Mello ได้รายงานการศึกษา RNAi และกลไกที่เกี่ยวข้องจากการศึกษาแสดงออกของยีนในหนอนตัวกลม Caenorhabditis elegans (C. elegans) โดยพบว่าเมื่อฉีด mRNA (sense) ที่ควบคุมการสร้างโปรตีนกล้ามเนื้อ ร่วมกับ antisense RNA ของ mRNA ดังกล่าว ให้แก่ C. elegan พบว่าหนอนมีการเคลื่อนที่แบบกระตุก (twitching movements) คล้ายลักษณะการเคลื่อนที่ของหนอนกลุ่มที่ขาดยีนที่ทำหน้าที่สร้างโปรตีนกล้ามเนื้ออย่างสมบูรณ์ ในขณะที่ การฉีดเฉพาะ sense หรือ antisense RNAเพียงอย่างเดียวไม่พบการเปลี่ยนแปลงดังกล่าว

จากผลการทดลอง Fire และคณะตั้งสมมุติฐานว่า sense และ antisense RNA ที่ถูกฉีดเข้าไปอาจจับเข้าคู่กันเกิดเป็น dsRNA และ dsRNA ที่เกิดขึ้นมีผลไปยับยั้งการแสดงออกของยีนกล้ามเนื้อที่มีรหัสเดียวกันนั้น ต่อมาเมื่อได้ทดลองฉีด dsRNA ที่มีรหัสพันธุกรรมของโปรตีนหลายๆชนิดของหนอนตัวกลม พบว่า การฉีดอาร์เอ็นเอสายคู่ที่มีรหัสพันธุกรรมหนึ่งๆเข้าไป มีผลในการยับยั้งการแสดงออกของยีนที่มีรหัสจำเพาะนั้นๆเมื่อได้ผลการทดลองที่ชัดเจน Fire และคณะ จึงรายงานว่า dsRNA มีความสามารถยับยั้งการแสดงออกของยีนได้ และเรียกกระบวนการที่เกิดขึ้นทั้งหมดนี้ว่า RNA interference (RNAi) ซึ่ง RNAi มีความจำเพาะต่อยีนที่มีรหัสเข้าคู่กันกับ dsRNA ที่ฉีดเข้าไป นอกจากนี้ยังพบว่า ผลจาก RNAi ที่เกิดในเซลล์ที่ฉีด dsRNA เข้าไป ยังสามารถแพร่กระจายจากเซลล์หนึ่งไปยังอีกเซลล์หนึ่ง ต่อๆ กันไป จนทั่วทุกเซลล์ของตัวอ่อนของหนอนตัวกลม และยังสามารถถ่ายทอดไปยังรุ่นต่อไปได้ด้วย และจากที่พบว่าการฉีด dsRNA เข้าไปเพียงเล็กน้อยสามารถก่อให้เกิดผลยับยั้งการแสดงออกของยีนได้ ทำให้เข้าใจว่ากระบวนการ RNAi เป็นกระบวนการที่อาจเกิดการสังเคราะห์เพิ่มขึ้นเองภายในเซลล์ได้ หลังจาก Andrew Fire และ Craig Mello รายงานการค้นพบกระบวนการ RNAi เผยแพร่ลงในวารสาร Nature เมื่อปี 1998 บทความนี้กระตุ้นให้เกิดความสนใจในการศึกษาเกี่ยวกับ RNAi เพิ่มขึ้นอีกมากมาย อาทิเช่น การศึกษาของ Misquitta และPaterson ที่พบการรบกวนการแสดงออกของ MyoD gene ใน Drosophila โดยใช้กระบวนการ RNAi การศึกษาของ Ngô และ คณะที่พบการกระตุ้นให้มีการทำลาย mRNA ใน Trypanosoma brucei โดยใช้ double strand RNA การศึกษาของ Waterhouse และ คณะที่พบกระบวนการต่อต้านการติดไวรัสในพืช ในปี 1998 และการศึกษาของ van West และคณะที่พบกระบวนการยับยั้งการแสดงออกของยีนใน Phytophthora infestans ในปี 1999 เป็นต้น ต่อมาในปี 2001 จากการศึกษาของ Elbashir และคณะพบว่า Duplexes of 21-nucleotide RNAs สามารถกระตุ้นให้เกิดกระบวนการ RNAi ในเซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมได้ และในปี 2002 วารสาร Science ได้ยกย่องว่า RNAi เป็นเทคโนโลยีแห่งปี ซึ่งในปีเดียวกันนี้ยังมีการค้นพบ recombinant Dicer โดย Provost และคณะ จากนั้นองค์ความรู้เกี่ยวกับ RNAi ในด้านต่างๆ ทั้งความรู้เกี่ยวกับกลไก องค์ประกอบในกระบวนการ RNAi ก็พัฒนาขึ้นเรื่อยๆ ตามลำดับ และจากการค้นพบกระบวนการ RNAi ทำให้ Andrew Fire และ Craig Mello ได้รับรางวัลโนเบล สาขาแพทยศาสตร์และสรีรศาสตร์ประจำปี 2006